作者：王涛 刘修恒 祝恒成 陈志远 王向阳
【关键词】 茵陈；,,抗病毒作用；,,巨细胞病毒,
摘要： 目的：探讨茵陈水溶性提取物溶液体外抗人巨细胞病毒(HCMV AD169)的效应。方法：采用细胞病变（CPE）抑制法观察茵陈水溶性提取物溶液对HCMV AD169 毒株的抑制作用，使用MTT比色法检测细胞的损伤程度，并利用吸光度（A）值评价茵陈水溶性提取物溶液的抗HCMV 的效应。结果：茵陈水溶性提取物溶液半数中毒浓度(TC50)为904.49 mg・L-1 ，半数有效浓度(IC50)为195.11 mg・L-1mg・L-1 ，治疗指数(TI)为4.64 。茵陈水溶性提取物溶液具有抗HCMV 的作用，且其作用随药物浓度的增高而增强。结论：体外实验证实，茵陈水溶性提取物是理想的抗HCMV 中药。
关键词： 茵陈； 抗病毒作用； 巨细胞病毒
巨细胞病毒（cytomegalovirus）是一种疱疹病毒科β属的双螺旋DNA病毒，在自然界广泛存在。正常人中CMV的潜伏感染率很高,血清学检查阳性率达40%~90%。普通人群感染后并不表现出症状,但在免疫缺陷或免疫抑制人群中却有极强的致病性, 肾移植后有症状的临床感染发病率是20%～60%,如果没有有效治疗,死亡率可高达90%。在器官移植术后,尤其在使用免疫抑制剂的情况下,受体感染CMV的机率更高［1］，甚至引起严重的CMV 疾病。CMV病治疗目前国内外都以更昔洛韦作为首选［2］,而目前常用的更昔洛韦等几种西药都存在毒副作用大、价位高、长时间使用耐药等缺点,临床观察表明在更昔洛韦耐药病人中易产生严重的并发症, 包括异体移植物的丧失、持久的视力损害等的发生率高达80%［3］。而传统的中药制剂毒副作用小,价格低廉,服用方便，同时还有其他如抗菌、提高免疫力等效能。本研究所采用CPE和MTT方法观察并测定茵陈水溶性提取物溶液对HCMV AD169 毒株液的抗病毒效用，为发现有效药物应用于临床防治巨细胞病毒感染提供实验依据。
1 材料与方法
11 材料
111 人胚肺成纤维细胞(HEL) 由山东省医学科学院基础研究所微生物研究室提供。实验所用为413代细胞。细胞生长液为RPMI1640溶液加10 %新生小牛血清,200 kU・L-1青霉素,200kU・L-1链霉素。细胞维持液为RPMI1640溶液加2%新生小牛血清,所加抗生素同生长液。
112 病毒 HCMVAD169 由山东医学科学院基础研究所微生物研究室提供,按常规增殖至实验需求量,测定半数组织培养感染数量TCID50 = 10-3.71。
113 药物 注射用更昔洛韦(GCV)购于广东阳江制药有限公司, 批号：国药准字H20033717,粉剂,每支250 mg。将GCV 溶于注射用水中,配制成50 g/L 浓度,临用时用维持液配成不同浓度的溶液。茵陈水溶性提取物由北京师范大学资源学院资源药物工程研究中心提供，临用时用维持液配成不同浓度的溶液。
114 主要试剂 MTT［3(4 ,6二甲基噻唑2xl )2 ,5乙苯基四唑溴盐］、新生小牛血清、胰蛋白酶、Hank氏液、HEPES及二甲基亚砜(DMSO)均购自北京鼎国生物技术公司; RPMI1640粉剂购自GIBCO。
115 主要仪器设备 超级酶标测试仪购自美国,型号规格550;二氧化碳培养箱购自美国，型号规格Nu1700E。
12 方法
121 病毒感染性滴度的测定 取经24小时培养后生长良好的HEL细胞,加入96孔板中，每孔100mL(约1.5×105/孔),将培养板置于5%CO2培养箱中,37 ℃培养18小时,待细胞长成单层,将病毒原液以10倍递次稀释法［4］稀释成9种不同浓度 (10-1 ,10-2 ,10-3 ,10-4 ,10-5,10-6 ,10-7,10-8,10-9),每个稀释度设8个孔,将9种不同浓度的病毒液分别接种到长成单层HEL细胞的96孔板,每孔25μL,,置于5 % CO2恒温培养箱内, 37℃吸附1h 后,弃上清,以Hank氏液洗3次,加维持液0.1 mL/孔,同时设细胞对照孔8孔,置37 ℃,5 % CO2培养箱培养,每日检查病毒生长情况,在光学倒置相差显微镜下观察细胞的形态变化并记录特征性细胞病变(CPE) 的孔数,12d 后记录结果。用ReedMuench 法［5］计算病毒的半数感染量(TCID50) 。
ReedMuench 法计算公式：TCID50=10-［（H－R）/（H－L）+E］
注：R为计算的死亡率，H为略高于50%的死亡率，L为略低于50%的死亡率，E为对应H死亡率的负指数。
122 药物细胞毒性试验 取生长良好的HEL细胞,将细胞加入96孔板,每孔100μL(约1.5×105/孔),待细胞长成单层后,同步化24h,用未含抗生素的维持液将GCV(药物对照组) 稀释成200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25，3.2mg・L-1等7个浓度;将茵陈水溶性提取物溶液亦稀释成2000，1000，500，250，125，63，32mg.L-1等7个浓度,将各浓度药物以每孔200μl加入培养板,每个浓度设4孔做实验孔,同时设正常细胞对照组各4孔。细胞MTT比色法：以CPE法观察记录药物对HEL细胞的毒性结果后，每孔加入MTT 染液20μL（5mg/ml） ,置5 % CO2 培养箱中，37 ℃培养4h ,可见细胞内形成甲赘结晶,弃染色液, 每孔加入DMSO 150μL ,振荡10 min ,直至紫蓝色沉淀(甲赘)充分溶解后,在超级酶标仪490 nm波长处测吸光度(A) 值,计算各药物浓度时TC50及细胞的存活率。试验重复3次，取3次平均值作为试验结果。
123 药物体外对病毒增殖的抑制作用 取生长良好的HEL ,以每孔100μL ( 约9.5 ×104个细胞/ 孔)的细胞悬液加入96孔板, 5% CO2培养箱中37 ℃培养24h ,细胞长成单层,同步化24h 后以每孔约100 TCID50攻击量攻击细胞,于5% CO2培养箱中, 37 ℃吸附1h,弃上清;将药液以低于IC50作8个稀释浓度分别加入细胞孔中,每孔150 μL ,每一稀释度设8孔,同时设立细胞对照组、病毒对照组;更换维持液隔天1 次;在5% CO2培养箱中, 37 ℃培养约8 d ,待病毒对照组细胞病变达到70%~80% 时,每孔加入MTT20μL ,继续培养4h ,吸弃上清,每孔加入DMSO150μL ,振荡10 min ,在超级酶标仪490 nm波长下测吸光度(A) 值, 按下列公式计算细胞存活率及治疗指数(TI)并采用用统计学软件SPSS11. 5 的Probit 回归法计算半数有效浓度( IC50) 。试验重复3 次,取平均值作为试验结果。
细胞存活率( %) = (试验组A 值/ 对照组A 值) ×100 %
TI = TC50/ IC50
124 光学倒置相差显微镜观察细胞的形态学变化 细胞培养96h后，IC50下,光学倒置相差显微镜下观察并比较各组的细胞形态。
13 统计分析
使用SPSS11.5 专业统计软件进行数据分析。实验数据以平均数±标准差(±s)表示,各试验组与病毒对照组间差异性采用t检验,P<0.05认为有显著差异。
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