1.2.5 肝微粒体蛋白抗原的鉴定 ①免疫沉淀法:按PIERCE公司试剂盒的说明书进行。②免疫沉淀后Western blot分析: 将以30 μL 2×上样缓冲液悬浮的人肝微粒体蛋白（抗原）、 用mAb进行免疫沉淀形成的抗原抗体复合物和纯化后的抗hCEⅡ mAb（纯化后的抗hCEⅡ mAb作为抗原虽不能与一抗mAb结合但可与二抗结合而显色）于95℃加热5 min, 置于冰上冷却10 min。将上述3种样品经10 g/LSDSPAGE分离后, 电转移至硝酸纤维素膜上, 以后的步骤均同特异性鉴定。③考马斯亮蓝染色法: 将上述3种样品经10 g/L SDSPAGE分离后, 用考马斯亮蓝染色。脱色后, 切下抗原抗体复合物泳道中与抗原泳道相对应而与mAb泳道不对应的蛋白带, 即为此mAb对应的抗原。④质谱鉴定: 用胰酶对免疫沉淀凝胶上的抗原蛋白, 于精氨酸或赖氨酸的C末端处进行断裂（其相邻氨基酸为脯氨酸时除外）。断裂后所产生的蛋白的Mr通过MALDITOFMS测量, 即得到相应的PMF数据, 通过Mascot在人类蛋白质数据库中分析比对鉴定mAb对应的抗原[5, 6]。
2 结果
2.1 杂交瘤细胞株的建立 按常规方法融合、 间接ELISA法筛选及3次亚克隆后, 得到1株可持续、 稳定分泌抗hCEⅡmAb的杂交瘤细胞系株（21D9）, 经体外连续传代培养, 液氮冻存半年以上, 复苏后仍生长良好, 说明其分泌mAb的性能稳定。
2.2 mAb的纯化及纯度鉴定 采用ProteinG免疫亲和层析法纯化mAb腹水后, 经SDSPAGE分离表明, 出现一条Mr约为55000 的带（重链）, 另一条Mr约为25000的带（轻链）, 未见其他的带（图1）。用BIORAD quantity one软件分析其纯度为96%, 为后续制备mAb的亲和层析柱提供了保障。
图1 抗hCEⅡ mAb的SDSPAGE分析（略）
Fig 1 SDSPAGE analysis of mAb against hCEⅡ
M: Protein marker; 1: Purified mAb.
2.3 抗hCEⅡ mAb的特性鉴定 ①效价测定: 间接ELISA检测表明, 腹水mAb的效价达1×10-7。②Ig亚类及型的鉴定: 用Ig亚类鉴定试剂盒检测表明, 该mAb为IgG1（κ）。③特异性鉴定: 以制备的人肝脏微粒体蛋白作为抗原, 以抗hCEⅡ mAb作为一抗, 进行还原及非还原性Western blot分析。结果显示, mAb与人肝脏微粒体蛋白在Mr约为62000处出现1条清晰的带, 与hCEⅡ的Mr相符（图2）, 说明所制备的mAb能与还原及非还原的人肝脏中的羧酸酯酶结合。
图2 抗hCEⅡ mAb特异性的还原与非还原条件下Western blot分析（略）
Fig 2 Analysis of anti hCEⅡ mAb specificity by reducing and nonreducing Western blot
M: Protein marker; 1: Nonreduced hCEⅡ in human liver; 2: Reduced hCEⅡ in human liver.
2.4 肝细胞浆蛋白的免疫组化染色检测 免疫组化染色的结果显示, 在1000倍光镜下, 可见抗hCEⅡmAb与肝细胞的浆蛋白结合（hCEⅡ存在于肝细胞质内微粒体。图3箭头1为阳性区, 箭头3为肝细胞核）, 而不与血管平滑肌细胞内的蛋白结合（图3箭头2阴性区, 箭头4为平滑肌细胞核）, 表明人肝细胞的浆蛋白中含有hCEⅡ抗原。
图3 人肝组织中hCEⅡ抗原的免疫组化染色检测（略）
Fig 3 Detection of hCEⅡ antigen in human liver tissue by immunohistochemical staining(×1000)
2.5 人肝微粒体蛋白抗原的鉴定 ①Western blot分析: 以制备的人肝微粒体蛋白（抗原）、 用mAb进行免疫沉淀形成的抗原抗体复合物和纯化后的抗hCEⅡmAb分别作为抗原, 以mAb作为一抗进行Western blot分析。结果显示, mAb与人肝脏微粒体蛋白在Mr约为62000处出现1条清晰的带, 与hCEⅡ的Mr（为61807）相符。mAb与其免疫沉淀形成的抗原抗体复合物, 分别在Mr约为62000、 55000、 25000处出现3条清晰的带, 分别与hCEⅡ、 IgG的重链及轻链分子量相符。以纯化后的抗hCEⅡmAb作为抗原, 虽不能与一抗mAb结合但可与二抗结合而显色, 因而在Mr约为55000处出现1条清晰的带, 与抗体重链的Mr相符（图3）。以上说明, 与mAb相对应抗原的Mr约为62000。②质谱鉴定: 免疫沉淀产物经SDSPAGE分离后作考马斯亮蓝染色, 将凝胶上抗原蛋白带切下做质谱分析表明, 该人肝微粒体蛋白抗原为hCEⅡ（图4、 5、 6）。
图4 免疫沉淀后所获蛋白的Western blot分析（略）
Fig 4 Analysis of protein obtained after immunoprecipitation by Western blot
M: Protein marker; 1: Human liver microsome protein; 2: Protein obtained after immunoprecipitation; 3: AntihCEⅡ mAb.
图5 人肝脏微粒体蛋白抗原与hCEⅡ的氨基酸序列比较（略）
Fig 5 Comparison of amino acid sequences between human liver microsome protein antigen and hCEⅡantigen
Matched peptides were shown in underline. The protein obtained after immunoprecipitation was cleavaged by Trypsin: Cterm side of lysine or arginine was cut unless next residue is proline. Number of mass values searched: 55. Number of mass values matched: 13. Sequence coverage: 27%.
图6 Mascot在人类蛋白质数据库中检索的结果（略）
Fig 6 The result of probability based Mascot
Top score: 99. Score is －10×Log (P), where P is the probability. Protein scores greater than 64 are significant (P<0.05).
3 讨论
以粗制的人肝脏微粒体蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠, 按常规方法融合, 用间接ELISA法筛选及3次亚克隆后, 得到1株可持续、 稳定分泌抗hCEⅡ的mAb的杂交瘤细胞系。mAb的腹水经ProteinG亲和层析纯化后, 纯度达96%。间接ELISA测定表明, mAb腹水的效价达1×10-7。Western blot分析表明, 制备的mAb与人肝脏微粒体蛋白在Mr约为62000处出现1条清晰的带, 与羧酸酯酶的Mr相符, 表明该mAb为抗人肝微粒体蛋白的抗体。还原及非还原性Western blot分析还表明, 该mAb能与还原及非还原的人肝微粒体蛋白结合, 提示此mAb与人肝微粒体蛋白相结合的抗原表位是线性的, 且位于此蛋白的表面。另外, 免疫组化染色显示, 该mAb只与肝细胞的浆蛋白特异性结合（hCEⅡ存在于肝细胞浆内微粒体）, 而不与血管平滑肌细胞内蛋白结合, 与文献[7]的报道一致。为了确定该mAb识别的抗原是否为hCEⅡ? 我们用免疫沉淀及MALDITOFMS得到相应的PMF数据。通过Mascot在人类蛋白质数据库中分析比对鉴定出mAb对应的抗原为hCEⅡ。迄今, 还没有纯化出天然的hCEⅡ。以往研究表明, hCEⅡ的亚细胞分布具有明显的差异性, 在人肝、 肾及脑等组织中, hCEⅡ主要位于微粒体的可溶性部分[7]。根据这一特点, 我们采用蔗糖密度梯度离心法, 用正常人肝脏组织制备含有天然hCEⅡ的人肝微粒体蛋白混合抗原。这样, 便可在没有天然hCEⅡ抗原的情况下, 制备出效价高、 特异性良好的抗天然hCEⅡ的mAb。抗hCEⅡ的mAb在蛋白质组学中具有重要的作用。另外, 由于hCEⅡ可促进依立替康、 卡培他滨等抗癌药的代谢[8, 9], 因而, 抗hCEⅡmAb的制备, 对于增强抗癌药物的疗效也具有重要的作用。最近研究表明, hCE可作为肝癌的标志物[2]。为此, 抗hCEⅡmAb的制备, 对建立检测hCEⅡ的方法, 精确分析其在肝癌组织及血清中的含量也具有重要的意义。
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