表1 各试验组GNLY mRNA含量的定量检测结果 (拷贝/μgRNA，x±s)
注：与正常对照组比较*P<0.01，与原发性胆汁性肝硬化比较**P<0.01，与正常对照组比较***P<0.01
3 讨论
1991年Holland等首次建立了荧光定量PCR的方法，实现了PCR从定性到定量的飞跃。荧光定量PCR TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3’→5’外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号，信号的强弱代表了模版的数量。荧光定量PCR以其特异性强、重复性好、定量准确、操作简便等优点成为研究基因表达的重要手段［5］。
原发性胆汁性肝硬化(PBC)是）是一种以肝内中小胆管的非化脓性进行性炎性损伤为特征的慢性胆汁淤积性疾病，最终发展为肝硬化的自身免疫性肝病。90％以上的患者血清中出现抗线粒体抗体（AMA）。GNLY由NK，CTL释放，在机体免疫应答过程中，与穿孔素、颗粒酶一起排出胞外，参与抗菌、抗病毒、杀伤肿瘤细胞等免疫过程。国外有学者研究在肾移植急性排斥患者的尿沉渣和外周血中GNLY表达增高［6］，但是在自身免疫病中未见相关报道。本研究采用定量PCR技术检测了60例PBC患者、60例乙型肝炎肝硬化患者和100例健康对照者PBMCs上GNLY mRNA的表达量。实验结果表明PBC组外周血GNLY mRNA表达与正常健康组和疾病对照乙型肝炎肝硬化组比较有显著性增高(P<0.01)，同时乙型肝炎肝硬化组GNLY mRNA表达低于正常健康组（P<0.01）。提示PBC疾病进展过程中CTL、NK细胞均被激活，其中CTL的T细胞受体（TCR）免疫识别表达在胆管上皮细胞上的MHC-抗原肽复合物后，向靶细胞释放GNLY发挥杀伤效应，导致CTL细胞对肝组织的细胞毒效应加强，胆管上皮细胞死亡，释出自身抗原。
本实验利用实时荧光定量RT-PCR的技术，首次证实了GNLY mRNA 在PBC患者中的表达上调，提示GNLY及其介导的细胞免疫应答与PBC的发生发展存在一定相关性。GNLY能否作为PBC早期诊断、病程监测及判断预后的指标，仍需要进一步研究探索。
1 Talwalkar JA， Lindor KD. Primary biliary cirrhosis. Lancet， 2003，362：53-61.
2 Tinmouth J， Lee M， Wanless IR， et al. Apoptosis of biliary epithelial cells in primary biliary cirrhosis and primary sclerosing cholangitis. Liver， 2002，22： 228-234.
3 Pena SV，Krensky AM.Granulysin， a new human cytolytic granule-associated protein with possible involvement in cell-mediated cytotoxitity. Semin Immunol，1997，9(2)：117-125.
4 Heathcote FJ. Management of primary biliary cirrhosis.The American Association for the Study of Liver Disease practice guidelines.Hepatology，2000，31：1005-1013.
5 Giulietti A， Overbergh L， Valckx D， et al. An overview of real-time quantitative PCR：applications to quantify cytokine gene expression. Methods， 2001，25：386-401.
6 Kotsch K， Mashreghi MF， Bold G， et al. Enhanced granulysin mRNA expression in urinary sediment in early and delayed acute renal allograft rejection. Transplantation，2004， 77(12)：1866-1875.
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