作者：潘曦明 潘景业 张近波 陈洁
【摘要】 目的 探讨失血性休克大鼠TM、TM mRNA的变化机制及参附的干预作用的研究。 方法 SD大鼠分成：假休克组，休克组，林格液复苏组，参附复苏组。休克及复苏2h 后，处死大鼠取出肝脏, Western blotting法测TM 变化，用RT－PCR法测TM mRNA的变化。结果 假休克组有 TM 、TM mRNA表达。休克组、林格液复苏组TM 表达下降，TM mRNA表达上调，与假休克组比较有显著统计学意义。参附复苏组TM 表达上调，TM mRNA 表达显著下调恢复，与假休克组比较无统计学意义，与休克组、林格液复苏组比较有显著统计学意义。结论 失血性休克TM 蛋白表达下降，TM mRNA表达上调，与休克损伤有关。林格液对蛋白C激活系统表达无明显调节作用。参附通过对内皮细胞的保护作用，具有抗休克作用。
【关键词】 失血性休克 凝血酶调节蛋白 参附注射液
【Abstract】 Objective To investigate the machenism of thrombomodulin (TM) TM mRNA changes in rats with hemorrhagic shock and the effect of Shenfu injection on them. Methods SD rats were assigned to the following four groups: sham shock; HS group; RS group; SF group. After start resuscitate for 2 hours ，the liver of rats were taken out and thrombomodulin was performed with Western blotting, The mRNA expression in liver of thrombomodulin was detected by reverse-transcription polymerase chain reaction(RT－PCR). Results The level of TM in liver obviously decreased in HS group, RS group, the mRNA expression of TM increased in HS group, RS group. Furthermore the level of TM in liver in SF group were significantly higher than that in HS group and RS group, the mRNA expression of TM in SF group was significantly lower than that in HS group or RS group. Conclusion The mRNA expression level of TM were significantly up-regulated, and expression of TM was down-regulated in liver of rats, which may be caused by the injury of hemorrhagic shock. Ringer's solution has no effect on the protein C activation complex in hemorrhagic shock. Shenfu injection has an anti-hemorrhagic shock effect by protecting endothelial cell from injury .
【Key Words】 Hemorrhagic shock Thrombomodulin Shenfu injection 创伤死亡的首要原因是失血性休克。2007年欧洲重症监护医学协会、欧洲休克协会等专家发表《控制大创伤后出血的治疗指南》，指出大出血患者常由血管损伤及凝血功能异常所致。血管内皮细胞的主要功能为抗血栓形成,这也是维持血液流动性的重要机制之一。PC系统发挥抗凝作用与血管内皮细胞上的凝血酶调节蛋白(thrombomodulin, TM) 、内皮细胞蛋白C 受体(endothelial protein C receptor, EPCR) 及血浆中的蛋白C(protein C,PC) 等有关。该系统是凝血酶生成后对凝血系统活化有负反馈作用的一个调节系统，不仅具有抗凝作用，而且在抗炎过程中发挥作用，当前重组人活化蛋白C对脓毒症休克的治疗已经取得了突破性的进展［１］。阐明PC系统在失血性休克的紊乱机制，对失血性休克的治疗及预后具有重要意义。作者2008年1至5月通过研究建立失血性休克大鼠模型，用Western blotting法检测肝脏内皮细胞TM 的表达水平，用RT-PCR法测TM mRNA的表达水平，观察失血性休克抗凝系统变化机制及参附的干预作用。
1 材料与方法
1.1 一般资料 选用温州医学院动物中心提供的Sprague Dawley(SD)大鼠40只，体重250～300ｇ。随机分为4组：假休克组(A组)，失血性休克组(B组)，林格液复苏组(C组)，参附复苏组(D组)，每组10只。按Lamson［２］的方法，改良后复制失血性休克动物模型。除A组外，其余大鼠均放血至40mmHg维持60 min，B组不复苏，C组用3倍失血量的林格液复苏；D组用含参附注射液 (10ml/kg)和林格液组成的3 倍失血量的液体复苏。休克及复苏2h 后，处死大鼠，立即取出其肝脏。
1.2 方法 （1）Western blotting法检测大鼠肝脏组织匀浆TM 含量：制备蛋白质样品，经SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE），转膜，加TM小鼠单克隆IgG 抗体（Santa Cruz公司提供）与抗原结合，加辣根过氧化物酶标记的TM山羊抗小鼠IgG（碧云天生物技术研究所提供）与一抗的结合，用联苯胺显色，Image master VDS成像系统摄影存盘后应用计算机图像分析软件(Quantity one 4.4.0)行灰度扫描分析。以目的基因与β-actin的条带灰度之比作为反映相对指标。(2)RT－PCR法检测大鼠肝脏组织匀浆TM mRNA含量：取肝组织约100mg, 以Trizol试剂盒一步法提取细胞总RNA , 采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT -PCR ) 技术对转录产物进行扩增, 扩增产物经质量分数为2% 的琼脂糖凝胶电泳后照相。电泳结果采用计算机图像分析系统(Gel-pro) 进行扫描, 以灰度值表示电泳带的强度。PCR所用引物采用Primer5.0计算机软件设计，用BLAST验证。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成提供。
1.3 统计学处理 数据以均值±标准差（x±s)表示，采用SPSS 12.0统计软件包处理，多组间相同指标的比较采用单因素方差分析，如差异有统计学意义则进一步行组内两两间比较，方差齐时采用LSD检验采用Student Newman Keuls法，方差不齐者采用Tamhane′s法。P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著统计学意义。
2 结果
A组大鼠肝组织有TM 、TM mRNA 表达。B组肝组织TM 表达下降， TM mRNA表达上调，与A组比较有显著统计学意义（P<0.01）。C组TM也表达下降，TM mRNA表达也上调，与A组比较有显著统计学意义（P<0.01），与B组比较无统计学意义（P＞0.05）。D组TM表达上调， TM mRNA表达显著下调恢复至A组水平，与A组比较无统计学意义（P＞0.05），与B组、C组比较有显著统计学意义（P<0.01）。见表1，图1～2。 表1 参附注射液对失血性休克大鼠肝组织TM 、TM mRNA表达的影响
3 讨论
血管内皮细胞对于调节凝血、抗凝、纤溶平衡具有重要作用。生理情况下,血管内皮细胞分泌凝血酶调节蛋白等抗凝物质,防止血栓形成。病理状态时,血管内皮胞分泌组织因子、纤溶酶原抑制剂等促凝物质,发挥止血作用。在失血性休克过程中,缺血、缺氧及氧自由基的释放导致血管内皮细胞损伤，组织因子释放入血, 大量凝血酶形成，血小板激活，血细胞大量破坏，引起凝血功能紊乱。
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