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重组CD13单链抗体/蝎毒素AGAP原核表达质粒的构建

来源:233网校论文中心[ 2011-04-03 09:20:00 ]阅读:1编辑:studa20

  2  结果

   2.1  AGAP目的基因的获得  通过RT-PCR成功获得AGAP目的基因,取5 μL PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳120 mV 30 min,紫外灯下见约219 bp处有一明亮目的条带,符合理论值大小,如图1所示。与Genbank中AGAP序列(No.AF464898)比对后同源性为99%。第77位碱基发生了突变,由T突变为C,但其所代表氨基酸并未发生改变,为无义突变。

  2.2  CD13 scFv目的基因的获得  通过PCR成功获得CD13 scFv目的基因,取5μL PCR 产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳120 mV 45 min,紫外灯下见约869 bp处有一明亮目的条带,符合理论值大小,如图2所示。测序结果与期望获得的基因片段完全一致。

  2.3  克隆质粒PCR-TOPO/AGAP的构建  将AGAP目的基因与PCR TOPO质粒连接转化DH5α菌后,见LB固体培养基生长约40个单个菌落(包括白色及蓝色菌落),挑取其中白色转化子,进行摇菌提质粒并用PCR、双酶切及测序鉴定后证明克隆质粒构建成功,酶切鉴定结果如图3所示。

  2.4  表达质粒pRSETA/AGAP/CD13scFv的构建  将AGAP用EcoR I和Hind III从克隆质粒上双酶切下与同样进行双酶切后的表达质粒pRSETA连接转化DH5α后,见LB培养基上生长约20个单个菌落,挑取1个单个菌落后摇菌提质粒,并用PCR、双酶切及测序鉴定后证明质粒pRSETA/AGAP构建成功,酶切鉴定结果如图4所示。将CD13scFv目的基因进行胶回收纯化后的产物及pRSETA/AGAP用EcoR I和Xho I双酶切后连接转化DH5α,见LB 培养基上生长约50个单个菌落,挑取1个单个菌落后摇菌提质粒,并用PCR、双酶切及测序鉴定后证明质粒pRSETA/AGAP/ CD13scFv构建成功,酶切鉴定结果如图5所示。

  3  讨 论

  近年来,治疗肿瘤的抗体药物研发取得了突破性的进展,抗体药物成为生物技术药物领域的热点之一。肿瘤抗体靶向药物主要是应用抗原抗体反应的原理构建,分为两大类,一类是以全抗体形式与肿瘤细胞靶点结合后利用ADCC或CDC作用直接杀伤肿瘤;另一类是将非全抗体或全抗体作为载体结合抗肿瘤药物,构建“生物导弹”,主要利用药物、生物毒素、放射性同位素对肿瘤实施生物疗法。ScFv是将抗体重链可变区和轻链可变区通过一段柔性短肽连接起来,由于只保留了可变区,免疫原性大大降低,因而成为导向药物的理想载体[4]。ScFv可与其他效应分子融合构建成多种具有双重功能的分子,最常见的如免疫毒素、放射性同位素标记的ScFv等[5-6]。

  CD13是最早被认定的区分正常或恶性髓性细胞的表面标志物[7],多年来用于对白血病或淋巴瘤细胞的定性和分型。文献表明不同的肿瘤细胞均已被检测出可以高度表达CD13。CD13不但能增强细胞侵袭性,有利于肿瘤转移,还能促进肿瘤新生血管形成,促进肿瘤细胞增殖,抑制肿瘤细胞凋亡。正因为CD13与肿瘤发生、发展有着密切关系,以CD13为靶点的靶向性抗肿瘤药物研究备受关注。

  东亚钳蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽(analgesic antitumoral peptide,AGAP)是刘岩峰[3]在2003 年从东亚钳蝎蝎毒中分离纯化得到的单组分活性肽。其cDNA(GenBank序列号AF464898)序列编码了19个氨基酸的信号肽、66个氨基酸的成熟肽。用表达载体PET28a在大肠杆菌中表达钳蝎镇痛抗肿瘤缬精甘成熟肽,重组活性肽主要以包涵体的形式存在,重组后的AGAP在小鼠体内试验具有抗肿瘤和止痛活性。

  本研究成功构建了含CD13scFv/蝎毒素AGAP融合基因的原核表达载体,旨在为今后在原核表达系统内表达重组目的蛋白作准备。其不但能使重组蛋白中CD13scFv通过各种途径杀伤肿瘤细胞,而且蝎毒素AGAP可以在CD13scFv的携带下积聚在肿瘤细胞周围,接着进一步进入肿瘤细胞内发挥靶向杀伤肿瘤细胞的作用,同时却不影响机体骨髓造血和免疫功能,并且可调节免疫,增强NK细胞的杀伤作用。本研究为CD13单链抗体和蝎毒素AGAP协同特异性杀伤CD13阳性肿瘤细胞提供实验依据,把先进的分子生物学技术引入中医药领域,开拓中药“以毒攻毒”抗癌新思路,开辟中药肿瘤生物治疗的新天地。  

参考文献】
  [1] 吴旭辉. CD13 靶向治疗研究进展[J]. 癌症进展杂志, 2006, 4(2):163-166.

[2] Liu YF, Hu J,Zhang JH, et al.Isolation ,purification,and N-terminal partial sequence of an antitumor peptide from thevenom of the Chinese scorpion Buthus martensii [J]. PrepBiochem Biotechnol,2002,32(4):317-327.

[3] Liu YF,Ma RL,Wang SL,et al. Expression of an antitumor-analgesic peptide from the venom of Chinese scorpionButhus martensii karsch in Escherichia coli [J].ProteinExpr Purif,2003,27(2):253-258.

[4] Suzuki M, Takayanagi A, Shimizu N. Targeted gene deliveryusing humanized single-chain antibody with negativelycharged oligopeptide tail [J].Cancer Sci,2004,95(5):424-429.

[5] Wen WH, Liu JY, Qin WJ,et al. Targeted inhibition of HBVgene expression by single-chain antibody mediated smallinterfering RNA delivery[J].Hepatology, 2007,46(1):84-94.

[6] Wen WH, Qin WJ, Gao H. An hepatitis B virus surfaceantigen specific single chain of variable fragment derivedfrom a natural immune antigen binding fragment phage dis-play library is specifically internalized by HepG2.2.15 cells[J].J Viral Hepat, 2007,14(7):512-519.

[7] Ashmun RA,Look AT. Metalloprotease activity of CD13/aminopeptidase N on the surface of human myeloid cells[J].Blood,1990,75(2):462-469.

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